我们先看一下实验数据的剖析效果，，，，，，，图表2可以看出无量纲剪切相关群集不适用于这些细胞。。。。。孵育时间和剪切速率的乘积在剪切装置内是恒定的，，，，，，，由于在更高的流速下，，，，，，，孵育时间镌汰的量与剪切速率的增添相同。。。。。因此，，，，，，，只要流动条件坚持层流，，，，，，，无量纲剪切是恒定的。。。。。可是，，，，，，，在更高的流速下，，，，，，，细胞的生涯能力会下降。。。。。这种降低也批注当剪切速率凌驾维持恒定无量纲剪切的阈值时，，，，，，，就会爆发细胞损伤。。。。。
接下来看一下受控剪切条件下举行的实验，，，，，，，看到有三种细胞系都能遭受比预期高得多的剪切速率。。。。。图 2显示所有细胞系都可以遭受高达 5 mL/min 的流速，，，，，，，这划分施加了高达 8.73 × 10 5 s -1和 5.82 × 10 5 s -1 的最大清静均剪切速率（表2）。。。。。在流速为 3 mL/min 和 5 mL/min 时 TCC 的增添可归因于细胞团块通过剪切装置的孔口时的疏散。。。。。然而，，，，，，，由 于10 mL/min 流速施加的剪切降低了 TCC 和 VCC。。。。。别的，，，，，，，我们视察到 VCC/TCC 比率急剧增添。。。。。然而，，，，，，，在较低的剪切速率下，，，，，，，由于细胞团块的疏散，，，，，，，剪切具有起劲的影响； ；；当细胞被过滤时，，，，，，，也会爆发团块疏散。。。。。
接下来研究职员又做了生物反应器的实验，，，，，，，主要验证之前的剪切实验效果，，，，，，，可以看一下A图和B图，，，，，，，图中TCC、VCC、viability和DO、air flow、stlrrer speed、 pure oyxgen划分体现主细胞数、活细胞数、细胞活力和消融氧、空气流速、搅拌器的旋转速率、纯氧。。。。。在作育历程中，，，，，，，熏染前后（虚线）和细胞活力（三角形）的总细胞数（TCC，，，，，，，填充符号）和活细胞数（VCC，，，，，，，空心符号）计数。。。。。( B ) 显示了消融氧 (DO) 水平、气流、搅拌器速率和气流中纯氧百分比的趋势。。。。。熏染的时间点由笔直粗虚线体现。。。。。在该参考实验中，，，，，，，细胞以 0.5 × 106细胞/mL接种并以分批模式生长，，，，，，，直至抵达 2 × 106细胞/mL。。。。。此时，，，，，，，细胞以MOI为1的杆状病毒事情病毒原液熏染，，，，，，，并用新鲜作育基稀释至1.0×106 细胞/mL（图 3A）。。。。。搅拌速率规模为100至160 rpm，，，，，，，对应于416 s -1和842 s -1的最大剪切速率，，，，，，，曝气速率规模为0.2至0.5标准升/分钟(SLPM)。。。。。效果批注，，，，，，，纵然在细胞浓度为 1.5 × 106细胞/mL，，，，，，，熏染后需要加入纯氧，，，，，，，以坚持消融氧水平在30%，，，，，，，阻止高搅拌速率。。。。。熏染导致细胞生长速率下降，，，，，，，熏染后 48 小时之后，，，，，，，细胞活力降低至 91.4%。。。。。
为了在搅拌下引入更高的剪切速率，，，，，，，研究职员改用配备一个 Rushton 叶轮的微生物生物反应器（SR1500DLS，，，，，，，Eppendorf DASGIP 系统）做实验。。。。。细胞在 500 mL 批量体积中生长，，，，，，，搅拌速率设置为 200 rpm (883 s -1 )，，，，，，，作为对应于盘算的 0.07 W/kg 比功率输入的起始值。。。。。气流坚持在恒定的 0.016 SLPM。。。。。细胞接种于 0.5 × 106 细胞/mL 并在不添加新鲜作育基的情形下以分批模式生长 72 小时。。。。。在批量运行时代细胞活力增添，，，，，，，细胞密度抵达4.5 × 106 个 细胞/mL（图 4A）。。。。。细胞活力不受 Rushton 叶轮爆发的剪切速率的影响，，，，，，，甚至剪切速率以高达 270 rpm (1385 s -1 , 0.17 W/kg) 的速率运行。。。。。
搅拌速率为 ( A , B ) 200 rpm，，，，，，，逐渐增添至 270 rpm； ；；( C , D ) 400 rpm，，，，，，，在 48 h 时步进到 800 rpm； ；；( E , F) 400 rpm，，，，，，，在 24 小时时步进到 1000 rpm。。。。。（图 4 C）以400rpm最先，，，，，，，以及一个办法增添800转的48小时后作育。。。。。曝气速率设置为 0.016 SPLM 以最大限度地镌汰气泡和泡沫的形成，，，，，，，由于在该实验中没有使用消泡剂。。。。。只管与其他批次相比，，，，，，，接种的细胞显示出低活力（与图4A较量），，，，，，，但它们的活力在前 48 小时内从 79.6% 增添到 82%。。。。。在之前的实验中也视察到了这种生涯力的增添（图 4A)，，，，，，，由此得出的结论是，，，，，，，由 Rushton 涡轮机以 400 rpm 提供动力的生物反应器不会影响昆虫细胞的生涯能力。。。。。在最初的 400 rpm 搅拌速率和低通气速率下，，，，，，，DO 水平在最初的 48 小时内从 100% 缓慢下降到 65%，，，，，，，在此时代作育物抵达 4.0 × 106细胞/mL的细胞密度。。。。。在 48 小时时，，，，，，，搅拌速率增添到 800 rpm，，，，，，，因此，，，，，，，在批次运行的最后 24 小时内，，，，，，，曝气速率设置为 0 SPLM。。。。。因此，，，，，，，在实验的最后几个小时内，，，，，，，DO 稳步下降到 0%，，，，，，，由于氧气有限，，，，，，，细胞最先殒命。。。。。另一次作育在 1 L 的事情体积下举行，，，，，，，但反应器配备了三个 Rushton 叶片，，，，，，，这是我们用于微生物作育的设置。。。。。24 小时后，，，，，，，将 400 rpm 的初始搅拌速率逐步提高到 1000 rpm（9872 s -1 , 8.54 W/kg）（图 4）E、F)。。。。。在此转变后 24 小时，，，，，，，生涯力最初下降了约 5%； ；；但在抵达 1000 rpm 的办法后 48 小时，，，，，，，存活率下降了 71.5%。。。。。这一视察效果可以通过高搅拌速率来诠释，，，，，，，这导致了液体涡流的形成，，，，，，，由于生物反应器中没有装置挡板。。。。。效果，，，，，，，特另外空气通过涡流外貌进入悬浮液，，，，，，，空气被拉什顿元件破碎成小气泡。。。。。因此，，，，，，，由于气泡破碎，，，，，，，与空气相关的细胞损伤增添。。。。。细胞无法遭受这些严酷的条件。。。。。
凭证前面实验中爆发的信息，，，，，，，我们在微生物生物反应器中设置了修改后的 DO 控制战略。。。。。目的是坚持尽可能低的气体流速，，，，，，，以最大限度地镌汰泡沫形成和气泡相关的剪切力。。。。。通过将搅拌速率与气流速率联系起来，，，，，，，调解了维持 DO 的 PID 控制战略。。。。。
我们可以看一下图5，，，，，，，实验分成2组，，，，，，，一组是未熏染细胞作育的历程，，，，，，，另外一组是熏染细胞作育的历程。。。。。
在初始阶段，，，，，，，叶轮速率设置为最小值（150 rpm，，，，，，，574 s -1, 0.03 W/kg)。。。。。然后，，，，，，，当 DO 水平抵达 30% 的设定点时，，，，，，，控制器被设置为逐渐增添搅拌速率，，，，，，，最高可达 800 rpm。。。。。搅拌器装有 Rushton 叶轮，，，，，，，L-sparger 用于分派曝气气体。。。。。在未熏染细胞的作育历程中，，，，，，，搅拌速率增添到300 rpm（1622 s -1，，，，，，，0.23 W/kg），，，，，，，在指数生恒久竣事时，，，，，，，TCC为6×106 个细胞/mL。。。。。气体流速设置为 0.03 SLPM 的最小值，，，，，，，但不幸的是，，，，，，，控制器无法坚持这个准确的流速（图 5 B、D）。。。。。在 TN42 昆虫细胞的两次作育中测试新的控制战略。。。。�？？？ ？？刂破髟� ( A , B ) 未熏染的批次作育和 ( C , D ) 熏染的批次历程中举行了测试。。。。。在这两种情形下，，，，，，，起始搅拌速率均为 150 rpm，，，，，，，控制器增添或降低速率以将 DO 坚持在 30%。。。。。同时，，，，，，，在 24 小时内收到病毒熏染的批次中测试了相同的历程控制战略。。。。。由于熏染和VLP生产，，，，，，，细胞生长阻止（图 5 C），，，，，，，但氧的消耗一连增添（图 5 d）。。。。。别的，，，，，，，在熏染时间点，，，，，，，通气率增添到 0.06 SLPM。。。。。与熏染批次的参考工艺（图 3）相比，，，，，，，在此设置中，，，，，，，无需添加纯氧，，，，，，，由于提高搅拌速率提供了有用的氧气转移。。。。。
为了确定由于搅拌速率增添引起的高剪切的影响，，，，，，，我们在事情体积为 500 mL 的 1.5 L 微生物 CSTR 生物反应器（SR1500DLS，，，，，，，Eppendorf）中以差别搅拌速率作育的两个 CHO 批次之间举行了直接较量。。。。。
一个生物反应器（图 6A、B）在低搅拌速率下运行，，，，，，，从 100 rpm 最先，，，，，，，曝气速率设置为 0.03 SLPM。。。。。通过逐渐增添搅拌速率将 DO 坚持在 30%，，，，，，，这模拟了标准的 CHO细胞 分批作育。。。。。第二生物反应器以增添的搅拌速率运行。。。。。在 200 rpm 的短暂调解阶段后，，，，，，，搅拌坚持在 300 rpm，，，，，，，通气速率为 0.03 SLPM。。。。。然后，，，，，，，在 48 小时后，，，，，，，搅拌增添到 600 rpm，，，，，，，曝气速率降低到 0.016 SLPM。。。。。在两个反应器中，，，，，，，喷雾器向作育基增补二氧化碳以控制 pH 值。。。。。通过较量微生物生物反应器中 CHO 细胞在差别搅拌速率下的两种作育来测试高搅拌速率的影响。。。。。( A , B ) 低搅拌速率（100 rpm）的标准分批作育； ；；( C , D ) 具有高搅拌速率（300 步进到 600 rpm）的批处置惩罚历程。。。。。 我们发明细胞生长速率在低和高搅拌设置下险些相同（图 6 A、C）。。。。。别的，，，，，，，在指数生恒久间，，，，，，，活力不受高搅拌器速率的影响，，，，，，，在接种后约 96 小时竣事。。。。。在高搅拌速率，，，，，，，消融氧勿使其低于80％在整个历程（图 6 d）。。。。。我们视察到在稳固阶段的生涯能力保存差别； ；；细胞生命力在搅拌速率越快生物反应器中下降速率越快。。。。。
研究批注 CHO 细胞可以用 Rushton 叶轮作育，，，，，，，参考文献也显示了这一点。。。。。在更高的搅拌速率下，，，，，，，不会损坏细胞。。。。。别的，，，，，，，空气流速可以坚持在最低水平，，，，，，，并且在整个历程中不需要添加纯氧。。。。。较高的搅拌速率和较低的空气流速，，，，，，，在分批作育历程中险些消除了泡沫； ；；因此，，，，，，，无需添加消泡剂。。。。。应用这种修改后的 DO 控制战略可以使 CHO 细胞作育抵达更高的细胞浓度。。。。。
研究中形貌的剪切装置是一种有用且简朴的工具，，，，，，，可将界说的剪切水平直接应用于细胞以表征其剪切敏感性。。。。。在本研究中，，，，，，，研究职员将剪切装置用于昆虫和 CHO 细胞，，，，，，，但它也可用于其他细胞系、病毒或 VLP，，，，，，，以确定临界剪切应力。。。。。通过 Rushton叶轮 动力反应器设计在低空气流速下通过相对较高的搅拌实现的氧气转移率，，，，，，，爆发比古板操作模式高得多的细胞密度。。。。。别的，，，，，，，这种设置也降低了气体流速并阻止了纯氧的应用。。。。。研发的控制机制具有提高历程经济效率的优势，，，，，，，但更主要的是，，，，，，，悬浮液中较低的气体体积也镌汰了液体外貌的泡沫形成和气泡破碎。。。。。这种征象会对细胞活力、病毒质量和产品（例如 VLP）爆发起劲影响。。。。。
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